BAB
1. PENDAHULUAN
1.1
Latar
Belakang
DNA
ditemukan baik dalam semua sel prokariotik dan eukariotik maupun dalam satu
klas virus. Dalam sel eukariotik diploid satu atau lebih molekul DNA bergabung
dengan poliamin dan protein dasar yang disebut histon. Bentuk gabungan ini
merupakan bagian utama dari struktur kromosom dari inti sel. Tambahan pula
eukariotik mempunyai molekul-molekul terpisah pada organ-organ kecil seperti
mitokondria dan kloroplas. Sel prokariotik mempunyai satu kromosom yang terdiri
dari satu DNA heliks rangkap dengan poliamin bermuatan positif.
Molekul
DNA tersusun dari dua rantai polinukleotida yang bergabung sepanjang seluruh
rantai dan bergulung menurut suatu sumbu untuk menghasilkan heliks (spiral)
rangkap. Bentuk heliks dasar adalah sama seperti α- heliks pada protein.
Struktur ini telah dikemukakan pertama kali dalam tahun 1953 oleh Watson dan
Crick yang dalam tahun 1962 menerima hadiah nobel dalam ilmu kedokteran untuk
sumbangan mereka. Serat-serat heliks rangkap tergabung dengan perantara ikatan
hidrogen antara basa-basa: A pada T dan G pada C.
RNA
menyusun 5-10% dar berat kering sel. Ada tiga macam RNA seluler:
1.
RNA penyampai (m-RNA)
yang bertindak sebagai cetakan untuk sintesa rantai protein.
2.
RNA ribosomal (r-RNA) yang
bertindak sebagai komponen asam nukleat pada struktur ribosom sebagai tempat
dilangsungkan sintesa protein.
3.
RNA pemindah (t-RNA)
yang bertindak sebagai pembawa asam amino spesifik pada pembentukan rantai
polipeptida (R. Soendoro, 1989).
DNA terutama
dijumpai dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode geneticdan dapat
mereproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-sel baru
untuk reproduksi organisme itu, dalam sebagian besar organisme, DNA suatu
sel mengarahkansintesis molekul RNA. Satu tipe RNA yakni RNA pesuruh (mrna)
meninggalkan inti sel danmengarahkan biosintesis dari berbagai tipe protein
dalam organisme itu sesuai dengan kodednanya (Pujiadi, 1994).
Pemisahan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dankarbohidrat dilakukan melalui
ekstraksi. Penggunaan nitrogen cair lebih memudahkan proses ekstraksi, namun
ekstraksi dengan bufer CTAB ditambah 0,2% β-mercaptoetanol danPVP mampu
mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer ini tidak memerlukan nitrogen cair
dan menghasilkan DNAgenom yang cukup baik. Ekstraksi tanpa nitrogen cair
lebihefisien, terutama bagi laboratorium yang sulit mendapatkan nitrogen cair. Penggunaan buffer CTAB sebagai pengganti nitrogen cair untuk ekstraksi
dapat menghasilkan produk DNA yang berkualitas yang ditunjukkan oleh pita DNA
genom. Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan untuk mengisolasi DNA pada tanaman
melinjo. Produk ekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pita DNA
yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi menggunakan image gel
elektroforesis (Ardiana, 2009).
DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan
kualitas untuk melihat konsentrasi dan kemurniannya
dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel.
Pengukuran konsentrasi DNA dengan
spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang
gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat
dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan
A280 nm. Batas
kemurnian yang biasa dipakai dalam
analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0 (SAMBROOK et al.,
1989). DNA yang sudah diukur konsentrasinya diencerkan sehingga mendapatkan
konsentrasi yang seragam untuk digunakan dalama nalisis PCR.
Selanjutnya dilakukan pengecekan kualitas DNA dengan elektroforesis gel
untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA dan keutuhan
DNA hasil isolasi. Reaksi amplifikasi
DNA dilakukan menggunakan Mesin PCR
(MJ Research tipe
PCT-100), dengan kondisi PCR sebagai berikut: satu siklus 3 menit pada suhu 94°C, dan diikuti dengan 45
siklus selama 1 menit pada suhu 94°C (denaturasi),
1 menit pada suhu 37°C (annealing),
2 menit pada suhu 72°C (ekstensi).
Seluruh produk amplifikasi DNA
dilengkapi dengan ekstensi selama
1 menit pada suhu 72°C.
Analisis PCR dilakukan dengan total reaksi
20 mikro liter mengandung 10
ng DNA genomic cetakan, masing-masing dNTP 0,1 µM (dATP, dCTP,
dGTP, dandTTP), masing-masing
primer RAPD 0,25
pmol, enzimTaq DNA polymerase
0,04 unit dalam larutan
buffer 1X (20 mMTris-HCl pH 8,0,
100 mMKCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50%
glycerol, 0,5%, Tween
20, 0,5% nonidet P40 dan MgCl2 1,5mM). Hasil amplifikasi
divisualisasikan menggunakan elektroforesis
horizontal dengan gel
agarose 1,5% (w/v) dalam
buffer 1x TAE.
Gel agarose kemudian direndam di
larutan EtBr, sehingga pola pita dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.
Hasil elektroforesis difoto menggunakan BIO-RAD Gel Doc™ EQ (Syafruddin,
2011).
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik
molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel
agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa
ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negative sehingga
di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif
(anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul
suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan
laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidiumbromid.
Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidiumbromid sebelum dipaparkan di atassinar ultraviolet.
Untukmemeriksaintegritas
DNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose.
Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA kita. Cara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang
diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer UV.DNA untaian tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027, DNA g
per-ml per-cm pada panjang gelombang 260 nm untaian ganda 0,02 dan RNA
0,025 Rasioabsorbsi 260/280 nm dapat digunakan untuk mengetahui adanya kontaminasi protein
ataufenol (protein memiliki absorbs maksimum pada 280 nm). Sampel DNA yang murni memilikirasio 260/280
nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan sampel RNA yang murni 1,9-2,0. Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang
signifikan yang masih tertinggal di dalam sampel. Saat ini sudah banyak dijual alat spektrofotometer otomatik yang secara otomatis mengkalkulasi rasio 260/280 nm dan kuantitas asam nukleat. Yang perlu diingat dalam penggunaan spektrofotometer adalah jangan lupa untuk selalu melakukan kalibrasi dengan larutan “blank” sebelum memeriksa konsentrasi asam nukleat sampel.Yang digunakan sebagai “blanko” adalah pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa
(Harisha, 2007).
1.2 Tujuan
Tujuan
praktikum Biokimia Tanaman acara Pengukuran Total dan Kemurnian DNA/RNA
adalah:
1.
Untuk mengisolasi
DNA/RNA guna memperoleh kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis.
2.
Untuk mengetahui
teknik-teknik isolasi DNA/RNA.
3.
Untuk mengetahui cara
kerja melakukan isolasi DNA/RNA.
BAB
2. BAHAN DAN METODE
2.1 Alat dan
Bahan
2.1.1 Alat
1.
Test tubes
2.
Mikropipet
3.
Spectrophotometer
4. Microwave
5. Tabung Erlenmeyer
2.1.2 Bahan
1. 0.25 gram agarose
2. 25 ml larutanTris-Borat-EDTA (TBE 1x)
3. 2 µl Ethedium
bromide
4. 6 µl DNA
5. 1 µl buffer
loading
2.2 Cara Kerja
Pembuatan
gel agarose:
1. Menyiapkan alat dan bahan yang
digunakan.
2. Menimbang
agarose 0.25 gran
3. Memasukkan
agarose ke dalam tabung
Erlenmeyer
4. Menambahkan TBE 1x 25 ml
5. Memanaskan
ke dalam microwave sebanyak 2 kali dengan waktu masing-masing
30 detik
dengan suhu lebih
dari 100o C
6. Menunggu
hingga hangat kurang
lebih 60o C
7. Menambahkan
ETBR 2 µl
8. Menuangkan ke dalam cetakan, menunggu hingga 15 menit
Elektroforesis
1.
Mengambil
sisir setelah beku,
kemudian
memasukkan gel ke dalam elektroforesis yang berisi TBE 1x.
2.
Mengambil 15 µl DNA, dan meletakkan di atas kertas paraffin kemudian tambahkan loading dye 3 µl pada tiap – tiap sampel.
3.
Mencampur dengan metode pipeting.
4.
Mengambil campuran sebanyak 5 µl dan 10 µl kemudian memasukkan dalam sumur gel.
5.
Memasukkan marker sebagai penanda.
6.
Me-Running selama 15 menit dengan tegangan 50 volt.
BAB
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1
Hasil
Hasil
praktikum isolasi DNA/RNA yaitu dapat dilihat dalam dokumentasi berikut :
Gambar 1.Foto Hasil Isolasi
DNA Biji Kakao
3.2
Pembahasan
Hasil elektroforesis
DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi. Hai ini dapat
dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA diagarose berhubungan
dengan besar moekul. Apabila pergerakannya tinggi maka DNA tersebut mempunyai
ukuran tidak terlalu besar. Apabila terdapat plasmid, berarti DNA total yang
diisolasi menunjukkan kemurnian yang tinggi. Akan tetapi dalam praktikum kali
ini pergerakan DNA tidak dapat diamati, hal ini disebabkan kareana kesalahan
teknis saat memaksukkan DNA ke dalam smur gel agarose. Bisa jadi DNA yang di
masukkan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel agarose. Selain itu
kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur gel
tersedot kembali masuk ke dalam mikro pipet, sehingga sumr tidak berisi DNA.
Berbagai teknik atau metode dapat
dilakukan untukmengisolasi DNA tergantung dari jenis tanaman, organtanaman atau
jaringan tanaman yang digunakan. Tetapipada dasarnya ada tiga faktor penentu
dalam ekstraksi danpurifikasi DNA secara optimal : 1) Penghomogenanjaringan
tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan bufferpada saat penggerusan biji/jaringan tanaman
sampel, dan3) Penghilangan enzim penghambat polisakarida khususnyauntuk tanaman
tahunan.
Tanaman melinjo merupakan tanaman
tahunan yang mengandung senyawa antioksidan, sehingga perlu dilakukanoptimasi
dalam mengisolasi DNAnya untuk memperolehDNA dengan kualitas yang tinggi. DNA
tanaman dengan kualitas rendah akan menyebabkan hasil amplifikasifragmen DNA
tidak optimum. Oleh sebab itu modifikasi pada metode ekstraksi yang sudah baku
pada tanaman tertentu perlu dilakukan.
Pada teknik ekstraksi melinjo digunakan
fenol kloroformyang berfungsi sebagai pendenaturasi protein.Sedangkan DNA dan
RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut di dalam pelarut organik
sepertifenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNAdengan menggunakan
etanol yang berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Apabila
fenol-kloroformmasih berada di dalam sampel maka ada
kemungkinan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lainyang
digunakan untuk analisis molekuler.
Proses penggerusan atau
homogenasi biji melinjo sampel tidak
menggunakan nitrogen cair, tetapi cukup ditambahkan 0,5 ml buffer ekstraksi
CTAB yang mempunyai fungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid
bilayer. Hasil pengecekan kualitas DNA dengan menggunakan gel elektroforesis 1%
juga menunjukkan hasil yang cukup memuaskan dimana DNA yang diperoleh terlihat
utuh namun agak suram karena resolusi gambar kameranya yang terlalu rendah. DNA
yang utuh ditandai dengan tidakadanya smear DNA yang dielektroforesis.
Hal ini menjadi penting karena pada proses PCR, DNA yang masih utuh akan lebih
memberikan hasil yang relatif lebih akurat.
Untuk membuktikan bahwa DNA
yang telah diperoleh mempunyai kualitas yang sangat baik maka DNA tersebut
digunakan sebagai cetakan (template) untuk analisis PCR dengan menggunakan
program RAPD. Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer RAPD OPB-17menunjukkan
bahwa DNA yang diamplifikasi menghasilkanpita DNA (amplikon) yang bagus dimana polapita DNA terlihat jelas dan tebal. Darihasil ini dapat
dikatakan bahwa teknik isolasi DNA yang dipakai dalam kegiatan ini adalah
sangat memberikan hasilyang nyata dan memenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi
DNA biji melinjo.
Keberhasilan di atas, telah
memberikan hasil bahwa dengan cara menghilangkan penggunaan nitrogen cair yang relatif
sulit didapatkan, di samping juga harganya yangcukup mahal, tanpa penyimpanan
sampel jaringan yang akan diisolasi serta dengan memodifikasi teknik yang digunakan
dapat memberikan hasil DNA yang murni dan pola pita yang jelas ketika dilakukan proses PCR. Hal ini
memberikan efek yang sangat signifikan pada pembiayaan dan efektivitas waktu,
sehingga proses analisis molekuler bisa lebih hemat dan cepat.
Dalam percobaan ini,
pengerjaan ekstraksi danisolasi DNA lebih difokuskan pada bagaimana
memodifikasi bahan kimia dan teknik yang digunakan, misalnya pada saat
penggerusan, pemvortekan sampel, dan pengaturan
temperatur annealing yang digunakan pada saat denaturasi. Dalam prosesnya juga sering terjadi kegagalan hal ini disebabkan karena proses denaturasi yang tidak sempurna.
Suhu yang diprogramkan biasanya 95°C selama30 detik atau 97°C selama 15 detik.
Dari hasil dokumentasi
tersebut tampak bahwa DNA/RNA terdapat pada tingkatan ke-3, yang memiliki berat
500 basepare. Hasil dokumentasi tersebut tidak terlalu jelas sehingga nampak
DNA/RNA menyatu, padahal seharusnya ada dua DNA/RNA dalam sampel tersebut yang
terpisah. Hal ini disebabkan karena kamera yang digunakan untuk
mendokumentasikan hasil isolasi DNA/RNA tersebut memiliki resolusi yang rendah.
DNA/RNA pada biji melinjo
tersebut tergolong cukup berat yaitu berada pada tingkatan ke-3 yang kira-kira
memiliki kisaran berat yaitu 500 basepare. Dari hasil ini maka pengisolasian
DNA/RNA cukup berhasil dengan metode yang sederhana dan waktu yang singkat.
Langkah – langkah dalam
isoasi DNA/RNA diatas dapat dilakukan dengan cara sebagai berikut :
1. Pembuatan
ekstraksi sampel
Dalam
membuat ekstraksi sampel kita membutuhkan biji melinjo yang telah masak untuk
digunakan sebagai sampel. Setelah sampel disiapkan timbang 1 g sampel kemudian
dilakukan penggerusan. Usahakan gerus sampel hingga halus. Hasil tumbukan
kemudian dimasukkan kedalam ependorf yang berisi 400 μl buffer AP1 dengan
menggunakan spatula. Buffer AP1 pada ependorf harus sudah disiapkan sebelum
penumbukan, sehingga pada saat daun telah halus secepat mungkin dimasukkan
dalam buffer untuk mencegah oksidasi akibat menguapnya nitrogen cair. Kemudian
dikocok menggunakan tangan (tapping) hingga semua partikel biji
tercampur merata dengan Buffer AP1.
Selanjutnya ditambahkan RNase sebanyak 4 μl (100 mg/mL) untuk
menghilangkan kontaminan RNA agar dihasilkan DNA bebas RNA, kemudian divortex
secepatnya. Larutan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit, posisi
ependorf cup dibolak balik atau diinvert. Selanjutnya ditambahkan 130 μl buffer
AP2 dan dihomogenkan dengan cara insersi atau dibolak-balik, setelah itu
secepatnya homogenan diinkubasikan pada pecahan es batu selama 5 menit. Homogenan disentrifuse selama 5 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm hingga diperoleh supernatant (letak ependorf cup harus
seimbang).
2.
Pembuatan
Gel Elektroforesis
Membuat
gel elektroforesis dengan konsentrasi gel 1% agarose yang terdiri dari tahap
menimbang agarose 0,25 gram selanjutnya masukkan dalam tabung erlenmeyer,
setelah itu menambahkan TBE 1x sebanyak 25 ml, selanjtnya dimikrowave 2x
masing-masing selama 30 menit dengan suhu diatas 100o C, keluarkan
dari microwave dan tunggu hingga hangat kurang lebih suhu 60o C,
kemudian tambahkan ETBR 2 µl, tahap terakhir yaitu tuangkan pada cetakan dan
tunggu gel sampai membeku kurang lebih selama 15 menit.
3.
Tahap
yang ketiga yaitu elektroforesis
Dalam
tahap ini setelah gel membeku, ambil sisirnya dan masukan gel dalam alat
elektroforesis yang berisi TBE 1x, setelah itu ambil 15 µl DNA, letakkan di
atas kertas parafin dan tambahkan loading dye 3 µl pada tiap-tiap sampel, tahap
selanjtnya yaitu mencampur dengan metode pipeting. Setelah selesai ambil
campuran sebanyak 5 µl dan 10 µl keudian masukkan dalam sumur gel. Masukkan
marker sebagai penanda, kemudian running selama 15 menit dengan tegangan 50
volt.
4.
Tahap
yang terakhir adalah mendokumentasikan dengan polaroid film di bawah sinar UV
atau menggunakan kamera beresolusi gambar yang tinggi.
BAB
4. PENUTUP
4.1
Kesimpulan
Dari
hasil yang kita peroleh dalam praktikum isolasi DNA/RNA maka dapat disimpulkan
sebagai berikut :
1. Hasil
elektroforesisi menunjukkan
adanya pita-pita DNA yang diisolasi.
2. Dari
hasil dokumentasi tersebut tampak bahwa DNA/RNA terdapat pada tingkatan ke-3,
yang memiliki berat 500 basepare.
3. Ada
tiga faktor penentu dalam ekstraksi dan purifikasi DNA secara optimal: 1)
Penghomogenan jaringan tanaman, 2) Komposisi penambahan larutan bufferpada saat
penggerusan daun/jaringan tanaman sampel, dan 3) Penghilangan enzim penghambat
polisakarida khususnyauntuk tanaman tahunan.
4. Metode
yang dilakukan dalam praktikum kali ini cukup berhasil, hal ini dapat dilihat
dari hasil dokumentasi
yang tampak bahwa letak DNA berada pada tngkatan ke-3 dari posisi marker.
5. Dari hasil dokumentasi, DNA sampel hasilisolasi terlihat memiiki DNA ganda, namun tidak terlalu jelas
dikarenakan kamera yang digunakan untuk pendokumentasian memilikiresolusi
panjang gelombang yang rendah.
4.2
Saran
Dalam
mendokumentasikan isolasi DNA/RNA harus menggunakan kamera yang mempunyai
resolusi gambar yang tinggi agar gambar yang diperoleh jelas. Serta dalam
mengisolasi DNA/RNA minimalisir terjadinya kesalahan teknis oleh praktikan agar
hasil yang diperoleh tepat dan benar.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana,DwiWahyuni.
2009. “TeknikIsolasiDnaGenomTanamanPepaya Dan
JerukDenganMenggunakanModifikasiBuferCtab”. BuletinTeknikPertanian 14(1). 12:16.
Harisha, S. 2007. Biotechnology procedures and experiments handbook (An introduction
to biotechnology).Infinity Science Press LLC. Hingham, MA. Canada.
Poedjiadi, A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Soendoro, R. 1989. Prinsip-Prinsip Biokimia. Jakarta : Erlangga.
Syafruddindan Tri JokoSantoso.2011.”OptimasiTeknikIsolasi Dan PurifikasiDNA Yang Efisien Dan EfektifPadaKemiriSunan (Reutalistrisperma (Blanco)
Airy Shaw)”.JurnalLittri 17(1). 11:17
LAMPIRAN
Gambar 01. Proses Pemasukan Sampel DNA ke Dalam Sumur Gel
Gambar 02. Hasil
Elektroforesis DNA Biji Melinjo
0 komentar:
Posting Komentar